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          熔解曲線耐藥結核檢測技術的原理及應用

          發布人:檢驗科 發布日期:2017/3/17 來源:本站 瀏覽:次 字號:

          隨著抗結核藥物的廣泛使用,耐多藥結核病人不斷增加。耐多藥結核病(multidrug resistant tuberculosisMDR-TB)是指至少同時對利福平(rifampinRIF)和異煙肼(isoniazidINH)這兩種一線抗結核藥物耐藥。傳統的藥物敏感實驗(Drug susceptibility testDST)時間長,不利于耐多藥結核病患者的及時診治。 因此,發展一種快速檢測耐多藥結核病的分子生物學檢測技術對于耐多藥結核病的早期診斷和治療十分重要。

          一、熔解曲線耐藥結核檢測技術的發展

          結核分枝桿菌利福平耐藥突變檢測試劑盒和結核分枝桿菌異煙肼耐藥突變檢測試劑盒于20131月獲頒國家食品藥品監督管理局(SFDA)醫療器械注冊證書,同時,“中國比爾蓋茨基金會”已將該試劑盒納入該基金會2013年產品驗證目錄。20169月,SFDA批準了另外三種試劑盒:“結核分枝桿菌氟喹諾酮類藥物耐藥突變檢測試劑盒”、“結核分枝桿菌鏈霉素耐藥突變檢測試劑盒”和“結核分枝桿菌乙胺丁醇耐藥突變檢測試劑盒”,分別用于檢測結核分枝桿菌對氟喹諾酮類藥物、鏈霉素藥物和乙胺丁醇藥物耐藥性,可用于臨床上結核病的輔助診斷。這些產品上市,有利于對耐多藥結核病患者及時診治,從而更好地控制與治療結核病。

          二、熔解曲線耐藥結核檢測的工作原理

          結核分枝桿菌異煙肼、利福平、氟喹諾酮、鏈霉素、乙胺丁醇耐藥突變檢測試劑盒均采

          用熒光PCR熔解曲線法進行檢測。熒光PCR熔解曲線法是一種簡單快速的PCR檢測技術,其主要檢測原理為耐藥基因的基因突變會導致DNA雙鏈的結合力下降,從而導致相應的DNA熔解溫度(Tm值)下降,即野生型基因有特定的Tm值,而突變型基因因為結合能力下降導致Tm值發生變化[1]Tm值下降的幅度與發生錯配的堿基數目、類型和位置有關,據此可以區分和檢測出突變型和野生型。

          三、熔解曲線耐藥結核檢測產品結構

          結核分枝桿菌利福平耐藥突變檢測試劑盒包含: 擴增試劑:PCR Mix APCR Mix B

          TB酶混合液; 對照試劑:陽性對照,含四個野生型擴增靶基因的質粒; TB陰性對照:不含靶基因的溶液。

           

           

          四、熔解曲線耐藥結核檢測的突變位點[2]

          抗結核藥物

          檢測的突變位點

          RFP

          rpoB 507534核心區位點

          INH

          ahpC啟動子區(-44-30以及-153位點)、inhA94密碼子、inhA啟動子區(-17-8位點)以及katG315 密碼子

          EMB

          embB306embB378- 380embB406embB497四個常見突變位點

          SM

          rpsL43rpsL88密碼子,rrs513517位點和rrs905908位點

          五、熔解曲線耐藥結核檢測的優點

          熔解曲線檢測試劑盒是目前市場上檢測項目最齊全的試劑盒,可實現MDRXDR

          一步檢測

          實驗全程采用閉管法操作,無PCR后處理,降低了擴增產物交叉污染的發生率[3]

          檢測時間較短(在3小時內完成),可實現自動判讀

          可在現有的實時熒光定量PCR分析儀上操作,不需要昂貴的專用設備

          熔解曲線法與現有其他檢測方法相比,檢測項目更為齊全,并且可在3h左右獲得藥敏結果,適用于耐多藥結核病的快速篩查,有利于更快的對耐多藥患者進行診斷治療并減少耐多藥患者的傳播。這種檢測方法對于我國結核病患者和結核病策略的影響還需要進行大范圍的、進一步的調查研究。

           

          參考文獻:

          [1] 蔡挺,李巧云,張順,等。基因芯片技術檢測常見革蘭陰性桿菌 耐藥基因的研究[J]。中華醫院感染學雜志,20112121):4411-4414

          [2] 嚴虹,施旭東,胡春梅,等。探針熔解曲線法快速檢測結核分枝桿菌利福平、異煙肼、乙胺丁醇及鏈霉素耐藥突變。臨床檢驗雜志,20153310):729-733

          [3] Qiu YHZan ZLYi QLet  alMultiplex fluorescence melting curve analysis for mutation detection with dual-labeled self-quenched probes [J]. PLoS One, 2011, 6( 4) : e19206

          渝公網安備 50010702500399號

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